Микроклональное размножение.

[Владимир Романович]

Здравствуйте. Да я занимался микроклональным размножением в домашних условиях. Но это было очень давно (около трех лет назад). Что Вас интересует?

[kentuha]

Все! Состав среды, способы стирилизации, выбор тканей, пропорции гормонов. Внаучных статьях в основном пишут о лабораторном производстве, хотелось бы узнать как это произвести на практике именно в домашних условиях. Начитавшись статей про семенное размножение орхидей http://sochi.gratuitiforum.com/t134-topic  решил не заморачиваться на поиске компонентов для среды MS. Есть несколько мыслей, не судите строго, именно по упрощению этого способа размножения. Вместо агар-агара крахмал, вместо набора солей обычное минеральное удобрение, антиоксидант аскорбиновая кислота с антибиотиком еще не определился думаю может просто заменить часть сахара медом с добавлением прополиса-сильнейший природный антибиотик. С ауксинами проблемы не будет корневин в любом магазине продаетсь, а вот цитокинины проблема почему и спрашиваю про препарат цитодеф N-(1,2,4-триазол-4-ил)-N-финилмочевина, думаю может им заменить. Хотелось бы узнать ваше мнение и не судите строго биологического образования у меня нет. И самый главный вопрос как добиться стерильности?

[kentuha]

Я прошу прощения если неправ, но микроклональное размножение это не семенное! Вот мой первый опыт[smg id=40948] [smg id=40949] Экспланты посаженны на среду 06.01.2012, из 4 пробирок в одной плесень уже колосится, в другой ткани отмирают, две вроде нормально пока. Поэтому и прошу поделиться опытом  Владимира Романовича. Цветонос фаленопсиса это одно, спящая почка и на безгормональной среде проснется! Хочеться узнать как правильно выбрать эксплант, какую именно часть листа брать, или может с орхидеями лучше корень, нигде не могу найти информации. Прошу прощения за качество фото.

[Asio Otus]

Я прошу прощения если неправ, но микроклональное размножение это не семенное! Вот мой первый опыт

Да, вы правы   Я видимо вас не точно поняла, так как  вы обобщенно написали, в таком случае можно выделить ваши сообщение в отдельную тему.  

[kentuha]

Я думаю можно если это кому нибудь будет интересно. Жалко Владимир Романович ничего не отвечает, но я могу и дальше писать о своих изысканиях в этой теме.

[marinka_aman]

kentuha Добрый вечер! Я так поняла на фото эксплантом вы называете часть цветоноса со спящей почкой? А среда какая? А температура? Пока Влад. Роман. занят мне эта тема интересна. Работала 10 лет в хим.лаборатории (было давно), но не было орхидей в то время и в том месте

[kentuha]

Среду варил так наобум: вода дистилиризованная-500мл, сахар-100гр, крахмал-50гр, удобрение "Изумруд"(судя по описанию в нем есть цитокинины)-3гр. Черенки цветоноса нарезал на части 1,5см над почкой, 1см под, внизу срез косой. Стерилизовал черенки в перекисе водорода 1,5% , Перенос на среду над паром. Теперь остается ждать что получиться! Следующую среду планирую варить уже на агаре и с гормонами, в качестве ИМК планирую использовать корневин, а вместо БАП цитодеф, жду когда привезут. Производитель суперцитокинин его называет и в широкое производство запускает. Теоретически я так понял можно заставить размножаться любую Растущую молодую ткань, и вот вопрос конец растущего воздушного корня ванды подойдет? Или к примеру лист пафиопедилума? Цель получить свободную от вирусов культуру, отсюда еще вопрос какие антибиотики лучше использовать? В качестве антиоксидантов планирую использовать аскорбиновую кислоту, ее лучше в среду добавлять или замачивать в ней перед посадкой? Вобщем вопросов много буду эксперементировать, хочется совет получить, чтобы время зря не тратить.                                                                                                                                              Чуть не забыл, температура 24-26 стоят под лампой 240V на растоянии 20см. Я если честно не очень на эти посадки расчитываю, но надежда теплется.

[marinka_aman]

 Спасибо за пояснение А результат посадки 50% это хорошо в домашних условиях. Будем надеятся до финиша что-то дойдет. Ростки  появятся- выкладывайте фотографии

[kentuha]

Спасибо! Я тоже думаю что 50% очень даже неплохо, тем более для первого раза. Дети фотоаппарат грохнули, но я что нибудь придумаю с фото.Мрина скажите а вы в лаборатории по этому профилю работали?

[Asio Otus]

в качестве ИМК планирую использовать корневин

Честно, не советовала бы вам использоваться в качестве ИМК именно корневин, так как, если его делали с нарушениями концентрации, а это имеет место быть, потому что сужу  по негативным отзывам после применения, и обсуждениями,  то получится совсем иной результат.

Ищите лучше чистую, к примеру, http://www.dia-m.ru/reactive.php?reactiveid=311

хочется совет получить, чтобы время зря не тратить.

Если у меня получится, я попробую проконсультироваться у человека который в лабаратории сам выращивает орхидеи, а вдруг   у него есть  подобный опыт.

[kentuha]

Спасибо за совет, ноя и корневин тоже попробую. буду делать варианты сред. Дело в том, что многих пугает именно сложность поиска необходимых компонентов для сред, а в моей голове роятся столько мыслей, вроде такой-"а что если...". Мне кажеться, что если бы можно было пойти в любой цветочный магазин, и купить там все необходимое то гораздо больше бы людей попробывали этот метод!  Буду очень прзнателен за любую информацию!

[Владимир Романович]

kentuha Добрый вечер! Я так поняла на фото эксплантом вы называете часть цветоноса со спящей почкой? А среда какая? А температура? Пока Влад. Роман. занят мне эта тема интересна. Работала 10 лет в хим.лаборатории (было давно), но не было орхидей в то время и в том месте

Здравствуйте. Извините за столь поздний ответ. У меня было много информации в электронном варианте, но я ее так и не смог отыскать. Перерыл все бумаги - тоже ничего. Остался только 1 килограм 6-БАП.

[marinka_aman]

вы в лаборатории по этому профилю работали

Работала химиком-токсикологом, приходилось и среды варить, на них  мы грибы выращивали патогенные (плесень). Агара было завались, да и остальных реактивов полно. Мы из них (хим.реактивов)  делали "цветочную смесь" для полива комнатных растений- росли монстры! У обыкновенного сциндапсуса листья были в диаметре 20 см., я таких больше нигде не видела

[kentuha]

Работала химиком-токсикологом, приходилось и среды варить, на них  мы грибы выращивали патогенные (плесень). Агара было завались, да и остальных реактивов полно. Мы из них (хим.реактивов)  делали "цветочную смесь" для полива комнатных растений- росли монстры! У обыкновенного сциндапсуса листья были в диаметре 20 см., я таких больше нигде не видела

Интересно ужасно, но боюсь не в тему! Сижу читаю курс по микробиологии, опять вопрос: микро размножение возможно осуществлять несколькими путями, один из них возникновение адвентивных побегов в каллусе, можно ли считать псевдобульбы орхидей каллусом? Вот кстати нашел сайт где есть описание как можно произвести опыты не имея стирильных условий
http://practice.biotechnolog.ru/ может кому то пригодится. Кстати интересный факт одна клетка даже на питательной среде никогда делиться не будет, только калонии. Возможно между клетками существует какая то связь???

[kentuha]

А вот что еще сегодня нашел- Микроклонирование - это реальная альтернатива среди традиционных методов размножения растений. Оно позволяет получать взрослые растения из малых частей, т.к. часть стебля, сегмент листа или корня, выращенные в асептическом (отсутствие микроорганизмов) контейнере с возможностью полного контроля среды. Получаемые растения полностью идентичны растениям - родителям. Выращивание «in vitro» производится в лабораторных условиях, но при соблюдении некоторых требований данные эксперименты могут быть успешно осуществлены у вас дома.
Оборудование, необходимое для выращивания культуры «in vitro»:
1.   Стерильное помещение, в котором будут производиться все операции. Идеально может подойти аквариум 50/40/40.
2.   Духовой шкаф для стерилизации посуды, инструмента и т.д.
3.   Стеклянные или пластиковые контейнеры с крышками, обладающие достаточной термостойкостью
4.   Скальпель и шипцы
5.   Офисная бумага формата А4
6.   Спиртовка
7.   Аэрозоль, содержащий 70% спирта для обработки поверхностей
8.   Хлоросодержащее дезинфицирующее средсто для обработки растений
9.   Дезинфицирующее средство для рук
10.   Питательная среда для растений
Приготовление питательной среды
Традиционно в роли питательной среды выступает среда MS (Мурасиге-Скуга), которую можно приобрести в некоторых химических компаниях. Но также можно самостоятельно приготовить подходящую питательную среду. Все составляющие широко доступны:
1.   2 чашки кипяченной воды
2.   1 часть сахарного песка
3.   Разведенное удобрение ( половина от нормы NPK 10/10/10 в 1 литре воды)
4.   Таблетка Иноситола 250 мг.
5.   ½ таблетки мультивитамина ( с тиамином)
6.   4 части агара
Это базовая среда. Для приготовления среды в целях мультипликации и укоренения необходимо добавить ½ часть кокосового молока и ½ чайной ложки солода. В итоге на нужно получить среду с Ph в диапазоне от 5 до 6. Если то не так, то необходимо добиться этих показателей путем подкисления (лимонная кислота) или подщелачивания (пищевая сода). Смешайте все перечисленные компоненты в кастрюле и варите на медленном огне до растворения агара. Затем разлейте получившуюся жидкость по подготовленным емкостям (примерно по 2 см.). Закройте емкости и поместите их в духовой шкаф на 15 минут для стерилизации.
Стерилизация инструментов и другого оборудования
Щипцы и скальпели могут стерилизоваться, будучи обернутыми в фольгу в духовом шкафу в течение 15 минут. Также их можно стерилизовать в хлорной жидкости или в спирте с последующим прокаливанием над огнем.
Стерильная вода необходима для того, чтобы ополаскивать растение, а стерильная бумага для того, чтобы его можно было просушить.Вода может стерилизоваться в стеклянных емкостях. Бумага в бумажном пакете стерилизуется паром в духовом шкафу над водой.
Стерлизация растительного материала
Весь материал необходимо стерилизовать в хлоросодержащей жидкости (подойдет отбеливатель)+ 3/4 воды + 1 часть моющего средства, которое снизит поверхностное натяжение ). Стерилизация занимает 10-20 минут. Производите периодическое взбалтывание. Этот процесс убьет бактерии и грибы. При более длительном отмачивание может произойти отмирание растительной ткани, будьте внимательны. Промойте растение дважды в стерильной воде.
Операции в стерильном помещение
К последующим операциям необходимо подойти с особым вниманием, чтобы не позволить микроорганизмам помешать вашей работе:
1.   Спрячьте волосы, засучите рукава и удалите часы и другие драгоценности. Вымойте свои руки дезинфицирующим средством, подходящим для кожи. Наденьте стерильные перчатки.
2.   Стерилизуйте внутреннюю часть аквариума спиртовым аэрозолем и вытрите стерильной бумагой.
3.   Расставьте все инструменты которые понадобятся вам в работе.
4.   Работая в аквариуме, возьмите стерильный растительный материал из емкости с помощью щипцов. Стерилизуйте свои инструменты, опуская их в алкоголь между каждой операцией. Допускается использование стебля с небольшими листочками, если листья большие их следует укоротить. В каждый контейнер помещают по одной части матерала. Затем контейнеры плотно закрывают крышкой и ставят в слегка освещенное место на месяц. В течение этого времени некоторые растения могут погибнуть из-за обработки хлором, некоторые будут заражены микроорганизмами, а некоторые начнут быстро расти в стерильных контейнерах. От зараженных растений необходимо избавиться.
Мультипликация
В течение месяца выжившие растения заметно выросли и их необходимо пересадить на среду, содержащую кокосовое молоко. Кокосовое молоко содержит вещества, способствующие быстрой сегментации и мультипликации растения. При пересадке растения необходимо повторить все вышеперечисленные операции, за исключением обработки растения хлоросодержащей жидкостью. Операции проводятся в стерильном аквариуме на влажной стерильной бумаге. Влажность необходима для растения, которое является достаточно мягким и может быстро высохнуть.
Формирование корня
Как только растение достигло как минимум 2 см в высоту можно начать процесс укоренения. Растение по привычной схеме пересаживается в среду из кокосового молока и солода. судно культуры. Корни формируются в течение двух - четырех недель.
Пересадка в почву (акклиматизация)
На данном этапе подготовленные горшки заполняют стерильной почвенной смесью без добавления удобрений. В почве делают небольшое углубление.
С помощью пинцета достают ратение из контейнера и отмывают теплой водой остатки агара с корней. Растение помещают в углубление, увлажняют из распылителя и накрывают горшок прозрачным колпаком. Постепенно приучайте растение к окружающей среде, периодически снимая колпак. Акклиматизация происходит в течение 4-6 недель. Затем переходят к привычном методам выращивания. Вот на этом саите- http://entheoworld.ru/enteobotanika/kultura-in-vitro-v-domashnix-usloviyax.html